IHC实验疑难解析大汇总
本周小编将带来IHC系列培训的最后一讲，IHC实验中各种常见问题的原因分析和解决方案。希望通过本次课程，您可以了解到 IHC 实验中出现异常情况时您可采取的措施。
一、切片无染色
IHC 中可能遇到的一个主要问题是无染色。出现这一问题的原因主要有三个：
蛋白表达量低/无表达
样本制备不良
试剂/方案问题
1、表达量低/无表达
确定目标蛋白的表达量，用工具查询，Uniport官网: https://www.uniprot.org/
了解目标蛋白表达的种属特异性和组织特异性，有时候目标蛋白在一些常见种属(如：人)有表达，并不表示在其他种属上也有表达。
解决方案：
在实验前查询文献，确定您待检测的目标种属和组织的表达量情况；
https://www.proteinatlas.org/，在这个网站上会提供人体组织的不同蛋白RNA表达数据和IHC数据，可以作为参考；
在实验方案中添加阳性对照组织样本，验证实验体系的正确性；
阳性对照的细胞系，一些情况下，可以选择确定会表达目标蛋白的细胞系作为阳性对照；
质量优良的抗体说明书上会给出建议的阳性对照样本，可以作为参考。
图1、人体不同组织的表达分布，来源：proteinatlas官网
2、样本制备不良
固定步骤：过度固定组织或固定时间不够；固定时使用福尔马林和多聚甲醛固定剂可能会遮蔽抗体识别的表位。
解决方案：
用不同的抗原修复方法暴露表位（用 pH 6 或 pH 9 缓冲液热修复、酶修复等）。
如果过度固定，则需要缩短固定时间。
可能脱蜡不充分
解决方案：
延长脱蜡时间，且需要使用新鲜二甲苯。
图2 、不同修复液对染色效果的影响
3、试剂/方案问题
一抗问题：
浓度太低：按照说明书上的建议，梯度稀释抗体后实验，选择合适的浓度。
孵育时间不够：尝试在 4°C 孵育更长时间（例如过夜）。
抗体可能不适用于IHC应用，因为其可能无法识别蛋白质的天然（3D）构象。
检查抗体数据表，查看其是否在 IHC 中得到了验证及其 IHC 的类型（石蜡切片、冰冻切片等）。抗体在免疫细胞化学（ICC）或免疫沉淀（IP）中的成功使用暗示了抗体能够识别蛋白质的天然构象。
二抗问题：
使用的二抗为抗一抗宿主的抗体（例如，如果在兔中生产一抗，则使用抗兔二抗）。检查一抗的亚型是否被二抗识别。
用其他蛋白的一抗检测二抗效果，确保二抗正常使用。
二、高背景
免疫组化染色之后的高背景是困扰很多实验者的常见现象，如果您遇到类似问题，可以对照下表的分析，尝试相应的解决方案。
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可能的问题原因 |
解决方案 |
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没有封闭或封闭不足 |
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一抗浓度可能过高 |
滴定抗体至最佳浓度，进一步稀释抗体并在 4℃ 孵育（缓慢孵育，但有针对性地结合效果最佳）。
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孵育温度可能过高 |
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二抗可能是非特异性结合 |
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组织冲洗不充分，仍残留固定剂 |
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内源性过氧化物酶具有活性 |
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检测系统是荧光显微镜，固定过程引起自发荧光 |
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信号扩增过多（间接技术） |
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应用过多底物（酶检测） |
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色原与组织样本中PBS 反应（酶检测） |
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通透破坏细胞膜并去除膜蛋白（膜蛋白） |
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三、非特异性染色
非特异性染色也是小编在日常工作中被问到频率较高的问题，希望下面这些建议一次性解答您的各种疑问。
一抗/二抗浓度可能过高。
尝试降低抗体浓度和/或缩短孵育期。可以与不表达靶蛋白的阴性组织进行比较。
内源性过氧化物酶具有活性。
用酶抑制剂，使用左旋咪唑 (2 mM) 抑制碱性磷酸酶，或用 H2O2 (0.3% v/v) 抑制过氧化物酶。
一抗是抗染色组织来源物种的抗体（例如在小鼠组织样本上使用小鼠一抗）。当应用二抗时，其与组织样本结合，因为其为抗该种属抗体。
使用的一抗为针对与您组织来源物种不同物种的抗体。
使用商业化试剂盒（例如，mouse on mouse 试剂盒：ab127055)。
切片/细胞已经干燥。
将切片/细胞保持在高湿度下以防变干。
总结
您现在应该已经完全了解了 IHC 的常见疑难问题知识，包括：
1、切片无染色的原因及解决方法；
2、遇到高背景染色结果时的处理方案；
3、排除非特异性染色时的做法。
希望您通过这次系列培训了解所有相关实验知识，使您可以顺利完成所有实验。IHC 的培训到这里就结束了。请务必把这些信息保存在安全的地方，以备日后参考。
本文内容来源于abcam官网。
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