Bio-techne|化学发光法：不是所有的 ELISA 都要测 OD 值哟
大家好，我是小菜鸡张三，万万没想到师兄让我寄几独立做 ELISA 了。这个我懂，平时跟着师兄勤学苦练，拍板加样我是有模有样。
待我左手一个 OD450 nm，右手一个 540，纳尼？化学发光法 ELISA 说明书上怎么没有 OD 值的要求啊？「少年郎，不是所有的 ELISA 都要测 OD 值哟。」暗中观察已久的师兄得意扬扬地飘过。
下面是小博士上课时间
什么是化学发光法 ELISA？
酶联免疫吸附测定法（ELISA）。首先将酶直接标记在抗原或抗体上，再经过抗原与抗体结合形成抗原抗体免疫复合物。通过不同底物与酶反应后产生的特定产物的特性，达到定量检测特定分子的目的。根据底物及相应产物的不同，ELISA 可分为比色法（Colorimetric）与化学发光法（Chemiluminescent）两类。
化学发光法酶联免疫分析系统（Chemiluminescent ELISA）是在免疫反应结束后，加入酶的发光底物，产生处于激发态的中间体。之后中间体会发射光子释放能量以回到稳定的基态，此发光强度可由光度计（Luminometer）进行检测，并利用标准曲线计算出被测物的含量。相比于比色法，化学发光法具有更高的灵敏度和更宽的检测范围。
常见的化学发光组合是鲁米诺（3-aminophthal hydrazide, Luminol）底物与辣根过氧化物酶反应。鲁米诺于 1928 年首次被合成为化学发光底物，该底物的发光反应需要苛刻的条件，发光暗淡且持续时间短。
之后研究人员发现，加入增强剂的增强型鲁米诺反应（图 1）能够长时间产生明亮且稳定的发光效果，从而使得其广泛应用于免疫分析，目前 R&D Systems® 的 QuantiGlo® 系列及 Novus Biologicals® 的 Chemiluminescent ELISA 均采用此原理。
图 1：增强 luminol/peroxide 底物用于化学发光检测
QuantiGlo® ELISA Kit 的基本检测步骤
第一步：向包被有捕获抗体的微孔板中加入样品或标准品，孵育使分析物与包被的抗体结合，将未结合的其他分子清洗掉。
第二步：加入 HRP 偶联的抗体（检测抗体）并与一抗捕获的分析物结合。未结合的检测抗体被冲洗掉。
第三步：加入增强的鲁米诺底物，使之与 HRP 反应发光，发光强度与样品中存在的分析物数量成正比。利用微孔板光度计测量发光强度。
QuantiGlo® 试剂盒检测参数设置及应用举例
如 QuantiGlo® 试剂盒说明书所列，光度计设定可以使用以下参数或同等参数：1.0 分钟滞后时间、检测时间 0.5 秒/孔、求和模式、自动增益或同等。
需要注意的是：
相对光单位（Relative light units，RLUs）数值由不同光度计检测可能不同，需要按照仪器制造商的建议调整设置。
相对光单位的数值可能在 15 分钟的阅读窗口期间内发生变化，由于需要参考标准曲线数值换算，所以这并不会影响结果。
应用举例 1：Human VEGF QuantiGlo ELISA Kit（货号 QVE00B）
使用 MOLECULAR DEVICE 品牌的 SpectraMax® L 微孔板化学发光酶标仪进行检测（SpectraMax® M5/M5e 和 FlexStation® 3 多功能酶标仪的化学发光检测模式也适用）。数据的收集和计算推荐由 SoftMax® Pro 软件完成，其预设的模板极大地简化了相应流程。
实验步骤及仪器参数设置：
1. 每孔加入 150 μL 实验稀释液 RD1-8；
2. 在微孔板中按 3 复孔形式加入 50 μL 标准品或空白对照（Calibrator 稀释液）。室温轻度振荡（推荐 500 ± 50 rpm）微孔板 2 小时；
3. 孵育结束后使用排枪吸干孔内反应液，并用 400 μL 洗涤液清洗 4 遍。最后吸干剩余洗涤液并在干净的吸水纸上拍干；
4. 每孔加入 200 μL VEGF 复合物，贴上新的粘合带。室温轻度振荡 (推荐 500± 50 rpm) 微孔板 3 小时；
5. 按照步骤 3 进行清洗步骤；
6. 每孔加入 100 μL Glo 工作液，室温避光孵育 5 至 20 分钟；
7. 用 SpectraMax® L 微孔板化学发光酶标仪测定 RLU 值。相关参数如下：1 秒检测时间，PMT 自动和 470 nm 目标校准波长。
结果：显示由 SpectraMax® L 微孔板化学发光酶标仪按照上述的参数所得的 VEGF 标准曲线, 其动态范围超过 4 个数量级，计算所得的检测限，也就是空白对照信号标准差 3 倍值的相应量为 1.5 pg/mL，与该试剂盒平均检测下限为 3.3 pg/mL 相符。
图 2，20,000-1.3 pg/mL 的标准品检测曲线图。实验由 SpectraMax® L 微孔板化学发光酶标仪按照 1 秒检测时间，PMT 自动和 470 nm 目标校准波长的参数进行读取。标准曲线由 SoftMax® Pro 软件绘制。
应用举例 2：Human IL-6 QuantiGlo ELISA Kit（货号 Q6000）
使用 DYNEX TECHNOLOGIES 品牌的 MLX™ 微量滴定光度计测量光的强度，绘制标准曲线，并分析结果。由于底物发光持续时间长，所以阅读窗口期可以是加入底物后的 20~40 分钟之间。实验步骤均严格按照试剂盒说明书操作。
仪器参数设定：
① 起始模式（Start Mode）：1 分钟滞后时间
② 振荡及温度设定：关闭（Off）
③ 检测选项：
软件操作：
① 只含有校准稀释液（Calibrator Diluent）的标准品零值孔被定义为空白孔（Blank）：
含有其他不同浓度标准品的孔被定义为 S1-S5 孔。
含有阳性对照（Control）的孔根据对应标签使用「用户可定义的类型（User Definable Types）」定义为 LL、L、M、H。
含有样本的孔需定义为测试品（Tests）。
② 在空白模式窗口中，选择平均（Average）。将所有空白孔（标准品零值孔）取平均值，其他孔值将统一减去这个平均值。
③ 在曲线拟合（curve fit）窗口中，输入 S1-S5 的 IL-6 标准品浓度，并在相对光（Relative Light）窗口使用 log/log Cubic Spline 模式拟合并绘制曲线。
④ 数据矩阵（Data Matrix）及拟合曲线图将呈现在测试报告（Test Report）中。
结果：
——「喔，我明白了，师兄选这个盒子是考虑到实验组间样本中目标分析物的含量差异大，过多的稀释操作一方面费时费力，另一方面容易造成误差对吧，师兄果然厉害！」
——「其实，主要还是因为我懒……」
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