研究背景

1、 新生儿真皮黑色素细胞是一个产生色素的细胞；

2、 皮肤色素沉着是一个多维度且复杂的过程；黑色素，在黑色素细胞中产生，在黑色素小体中包装，随后胞吐到细胞外，接着被相邻的角质细胞内吞。

3、 许多基因在不同水平上控制着色素沉着和黑色素生成中发挥作用。

4、 这些基因突变是多种皮肤疾病的特征，包括色素沉着，色素减退和混合性高/低色素沉着。

5、 此外，周围其他固有细胞分泌的外部因素也调节着黑色素在黑色素细胞中表达。

6、 人类原代细胞可以作为阐明黑色素细胞生物学及其对皮肤制剂毒性的有用模型。然而，原代细胞有其局限性，例如供体的差异性和有限的寿命。因此，研究者需要一个更强大的人类黑色素细胞模型系统，用于研究皮肤色素沉着和影响色素沉着的因素。

解决方案

根据客户需求开发人永生化新生儿皮肤黑色素细胞系：CRL-4064

1、 通过在原代新生儿皮肤黑色素细胞（ATCC®PCS-200-012™)中插入过度表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白，建立了人永生化新生儿皮肤黑色素细胞系。

2、 这种新建立的细胞系，可以用作人永生化真皮黑色素细胞系（ATCC®CRL-4059™)体外毒性研究和色素沉着调节的细胞模型的补充。

3、 且该新生儿细胞来自于亚裔供体。

产品信息

黑色素细胞标记物表达

图1、永生化黑色素细胞均匀表达黑色素细胞特异性标记物TRP1，不表达成纤维细胞特异性标记物TE7。用4%多聚甲醛固定hTERT黑色素细胞，然后在PBS中用0.2%Triton x-100、0.1%吐温-20和10%正常山羊血清溶液做浸润封闭。然后细胞在含有0.05%吐温-20 和2%NGS的PBS溶液中，1:400小鼠抗人的一抗中进行染色。之后对细胞进行洗涤，然后以1:400稀释的Alexa fluor 488结合的山羊抗鼠二抗IgG进行染色。最后细胞用PBS稀释的1:5000 Hoechst核染色进行复染，并用尼康Ti-eclipse成像倒置显微镜和20x物镜进行观察。（比例尺为100微米）

细胞形态

图2、hTERT永生化新生儿黑色素细胞形态与典型的黑色素细胞形态类似。用高倍和低倍倒置显微镜在10倍物镜下拍摄贴壁黑色素细胞的融合图像。（比例尺为82微米）

常见问题

Q1、hTERT新生儿黑色素细胞系是如何产生的？

答：CRL-4064是通过逆转录病毒转导产生的。病毒颗粒是通过转染BABE-puro-hTERT质粒导入Phoenix AMPHO（CRL-3213）包装细胞产生的。原代细胞被病毒感染后，接受抗生素加压选择，并挑选阳性的单细胞克隆。

Q2、永生化是如何确定的？

答：从两个方面来看，寿命测试：该细胞系在35个群体倍增后，生长率没有下降，端粒酶也没有下降，通过TRAP（端粒酶重复扩增方法）检测活性。与CRL-1573阳性对照组比较，这些细胞显示出高的 (≥ 8个重复DNA单元）端粒酶活性。

Q3、hTERT新生儿黑色素细胞的推荐培养基是什么？

答：该细胞系在真皮细胞基础培养基（PCS-200-030）中与成人黑色素细胞生长试剂盒（PCS-200-042）和0.5微克/毫升嘌呤霉素（维持hTERT表达）中生长。

Q4：CRL-4064细胞系的主要用途是什么？

答：CRL-4064旨在替代原代细胞，用于毒理学或药物筛选应用，以应对原代细胞在培养中的寿命短暂的问题。该细胞也可用于基因调控研究。

Q5、原代黑色素细胞和hTERT黑色素细胞系之间有什么区别？

答：hTERT黑色素细胞继续分裂，超过了典型的Hayflick限制的~15个PDL，在高传代次数时，它们甚至没有表现出生长停滞。ATCC提供了两种hTERT永生化黑色素细胞系：CRL-4064为新生儿供体的，CRL-4059为成人供体的。